產(chǎn)品介紹

基 因 型MATα, ura3, his3, trp1, LexAop (x6)-LEU2簡 要 說 明EGY48菌株是Clontech公司開發(fā)的LexA 系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)用菌株，MATa型，可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫試驗(yàn)；Transformation  marker為: his3, trp1, ura3，報(bào)告基因?yàn)椋篖EU2；報(bào)告基因UAS（上游激活序列）來源于LexA op(x6)，只有當(dāng)Bait和Prey互作時(shí)才能啟動LEU2表達(dá)。EGY48-LexA酵母雙雜系統(tǒng)系統(tǒng)需要三種質(zhì)粒配套使用：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ。質(zhì)粒pLexA的篩選標(biāo)志為HIS3，用于表達(dá)DNA-BD(來自原核的202個(gè)氨基酸殘基組成的LexA蛋白)與目標(biāo)蛋白(Bait)的融合蛋白；質(zhì)粒pB42AD的篩選標(biāo)志為TRP1，用于表達(dá)AD(來自皰疹病毒的88個(gè)氨基酸殘基組成的B42AD蛋白)與目標(biāo)蛋白（Prey）的融合蛋白；報(bào)告質(zhì)粒p8op-LacZ的篩選標(biāo)志為URA3，報(bào)告基因?yàn)長acZ，報(bào)告基因UAS來源于LexA op(x8) ，只有當(dāng)Bait和Prey互作時(shí)才能啟動LacZ表達(dá)。High5TM系列Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，-80℃可保存三個(gè)月，經(jīng)PGBKT7質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104cfu/μg DNA 。操 作 說 明1.取1管感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，6 000 rpm離心1min，去掉上清。2.加入320 μl LiTE/PEG溶液，重懸細(xì)胞，然后加入10μl Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重復(fù)一次)，預(yù)冷目的質(zhì)粒2-5ug,體積不多于20ul。3.充分混勻，于30度250 rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)30 min。4.42度熱激2.5min。5.6000 rpm離心1min，去掉上清。6.加入1 ml TE溶液，溫和重懸細(xì)胞。7.6000 rpm離心1min，去掉上清。8.加入100 μl TE溶液，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞涂布于相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型固體合成培養(yǎng)基。9.30度倒置培養(yǎng)48-96h，直至形成大小合適的酵母菌落。Preparation of Media：YPDA （1L）:Tryptone                20gyeast extract             10g 0.2% adenine            15ml補(bǔ)水到 950ml，  用鹽酸調(diào)PH到 6.5Agar                 20g (for plates only)121度，15分鐘高壓滅菌，待培養(yǎng)基溫度降到55度時(shí)，加入已過濾的40% 葡萄糖 50 ml0.2% adenine(1L)Adenine    2g補(bǔ)水 到1L，溶解后高壓滅菌或0.22um濾膜過濾除菌注 意 事 項(xiàng)1.感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。2.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。3.同時(shí)轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時(shí)可增加質(zhì)粒的用量。4.EGY48酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高于31℃，生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。5.酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉(zhuǎn)化涂板為例：涂YPDA平板29℃，48h培養(yǎng)可見直徑1mm克??；涂SD單缺平板29℃，48-60h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養(yǎng)可見直徑1mm克隆。

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